Vorwort xiii
Zum Aufbau des Buches xv
Beitragsautoren xvii
1 Wann sollte ich meine UHPLC als UHPLC betreiben? 1
S. Kromidas
1.1 Was möchte ich erreichen und was kann die UHPLC? 1
1.2 Anforderungen an eine HPLC-Methode 3
1.2.1 Gut trennen 3
1.2.2 Schnell trennen 13
1.2.3 Massenempfindlichkeit verbessern (konstantes Injektionsvolumen) 15
1.2.4 Robuste Trennungen gewährleisten 17
1.3 Die UHPLC im Alltag 19
1.4 Wie kann das Potenzial der UHPLC tatsächlich ausgeschöpft werden? 23
1.5 Zusammenfassung und Ausblick 26
Literatur 29
Teil 1 Hardware/Software Spezifika, Trennmodi, Materialien 31
2 Die moderne HPLC-/UHPLC-Anlage 33
2.1 Heutige Anforderungen an die einzelnen Module 33
S. Wiese
2.1.1 Überblick 33
2.1.2 UHPLC-Pumpentechnik 34
2.1.3 Autosampler 41
2.1.4 Säulenofen 47
2.1.5 Detektoren 50
2.1.6 Kapillaren/Verschraubungen 53
Literatur 57
2.2 Der Säulenofen eine einfache Angelegenheit? 59
M. Heidorn und F. Steiner
2.2.1 Thermische Betriebsweisen von Säulenöfen 62
2.2.2 Temperaturunterschiede zwischen mobiler Phase und LC-Säule 64
2.2.3 Reibungswärme nur ein Phänomen der UHPLC? 69
2.2.4 Thermostatisierung in der Methodenübertragung 76
Literatur 79
3 Das Problem der externen Bandenverbreiterung in einer HPLC-/UHPLC-Anlage 81
M. Dittmann
3.1 Theoretischer Hintergrund 83
3.1.1 Effizienz und Peakauflösung moderner UHPLC-Säulen 83
3.1.2 Bestimmung der Peakvolumina 85
3.2 Externe Bandenverbreiterung in UHPLC-Systemen 87
3.2.1 Die Ursachen externer Bandenverbreiterung in HPLC-/UHPLC-Systemen 87
3.2.2 Experimentelle Bestimmung der externen Bandenverbreiterung 97
3.3 Auswirkung externer Bandenverbreiterung in verschiedenen Applikationsbereichen 100
3.3.1 Einfluss auf isokratische Trennungen 100
3.3.2 Auswirkungen auf Gradiententrennungen 100
3.4 Optimierung des HPLC-/UHPLC-Systems 104
3.4.1 Test der Säuleneffizienz 105
3.4.2 Andere isokratische Trennungen 105
3.4.3 Hochauflösende Gradiententrennungen 106
3.4.4 Schnelle Gradiententrennungen 106
3.5 Zusammenfassung 107
Literatur 108
4 Der Gradient Anforderungen, optimaler Einsatz, Tricks und Fallstricke 111
F. Steiner und M. Heidorn
4.1 Apparative Einflüsse bei der Gradientenelution ein Überblick 111
4.1.1 Gradientenverweilvolumen oder Gradientenverzögerungsvolumen 111
4.1.2 Rolle des Gradientenmischers 113
4.1.3 Auf physikalisch-chemischen Phänomenen beruhende Unterschiede zwischen Gradientenpumpentypen 115
4.1.4 Apparative Einflüsse außerhalb der Pumpe 121
4.1.5 Belastung und Abnutzung von Säulen bei Gradientenmethoden 124
4.2 Technische Umsetzung und Charakterisierung von Gradienten- Hplc 125
4.2.1 Wissenswertes und Grundlegendes zum Einfluss der bei Gradientenpumpen angewandten Förderund Dosierungstechniken 126
4.2.2 Notwendigkeit der Entgasung der Laufmittelkomponenten 128
4.2.3 Verschiedene Pumpentypen (seriell, parallel, Nockenantrieb, Spindelantrieb) und ihre Spezifika 130
4.2.4 Auswirkungen der Pumpenbauart auf die Anwendung im Gradienten 134
4.2.5 Auswirkungen der Arbeitszyklen auf die Chromatographie und notwendige Abstimmungen bei HPG-Anlagen 135
4.2.6 Auswirkungen der Arbeitszyklen auf die Chromatographie und notwendige Abstimmungen bei LPG-Anlagen eine gänzlich verschiedene Problematik 139
4.2.7 Thermische Effekte in einer Gradientenpumpe und ihre Auswirkungen 141
4.2.8 Methoden mit besonders steilen (ballistischen) Gradienten 142
4.2.9 Grundsätzliches zur Bestimmung des Gradientenverweilvolumens einer Apparatur 149
4.2.10 Die Markerpulsmethode als eine quick-and-dirty Lösung 150
4.2.11 Die Dolan-Methode ein Klassiker und seine Varianten 152
4.2.12 Wie eine effektive Mischung bei einem angemessenen GDV technisch erreicht werden kann 154
4.2.13 Charakterisierung der Mischungseffizienz und Gradientenformung einer Apparatur 160
4.2.14 Richtiges Mischervolumen in Abhängigkeit von Pumpentyp, Flussrate und Applikation am Beispiel von TFA-Gradienten 166
4.2.15 Gradientenmischung und die Besonderheiten bei der Elution von Proteinen 173
Literatur 174
5 Anforderungen bei der (U)HPLC-Kopplung mit unterschiedlichen Massenspektrometern 175
T. Teutenberg, T. Hetzel, C. Portner und J. Türk
5.1 Einleitung 175
5.2 Von der Target-Analytik zu Screeninguntersuchungen 176
5.2.1 Target-Analytik 176
5.2.2 Suspected-Target Screening 176
5.2.3 Non-Target Screening 177
5.3 Was ist bei der Kopplung von UHPLC und MS zu beachten? 178
5.3.1 DasInterfaceunddieoptimaleFlussrate 178
5.3.2 Optimierung der massenspektrometrischen Parameter 179
5.3.3 Optimierung der chromatographischen Parameter 179
5.3.4 Auswahl der geeigneten Säule und Säulengeometrie 181
5.4 Target-Analytik mittels Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie 184
5.5 Screening mittels LC-MS 192
5.6 Miniaturisierung LC-MS quo vadis? 197
Literatur 201
6 2D-Chromatographie Möglichkeiten und Grenzen 203
T. Teutenberg
6.1 Einführung warum zweidimensionale HPLC? 203
6.2 Peakkapazität ein- und zweidimensionaler HPLC-Verfahren 205
6.2.1 Peakkapazität eindimensionaler Trennverfahren 205
6.2.2 Peakkapazität zweidimensionaler Trennverfahren 206
6.3 Modulation 210
6.3.1 Online Heart-Cut 2D LC 210
6.3.2 Umfassende Online 2D LC 211
6.3.3 Stop-Flow und Offline LC × LC 213
6.4 Praktische Probleme der online LC × LC 214
6.4.1 Kompatibilität der Lösemittelsysteme 214
6.4.2 Verdünnung 214
6.4.3 Hohe Flussraten 214
6.4.4 Kompatibilität mit Massenspektrometrie 215
6.5 Realisierung eines miniaturisierten LC × LC-Systemaufbaus 215
6.5.1 Technische Plattform 215
6.5.2 Auswahl der stationären Phasen 216
6.5.3 Auswahl der mobilen Phase und Temperatur 217
6.5.4 Säulengeometrie und Modulation 217
6.5.5 Gradientenprogrammierung und Gesamtanalysenzeit 218
6.5.6 Kopplung mit Massenspektrometer 218
6.6 Applikationsbeispiel 219
6.6.1 Messung eines Referenzstandards 219
6.6.2 Messung einer Realprobe 221
6.7 Vorteile der MS/MS-Funktionalität 222
6.8 Offline LC × LC versus Online LC × LC 223
6.9 Lösungen der Gerätehersteller (in alphabetischer Reihenfolge) 226
6.9.1 Kommerziell verfügbare Gesamtlösungen für die LC × LC 227
6.9.2 Weitere Systemlösungen 228
6.10 2D-LC quo vadis? 228
6.10.1 Software 228
6.10.2 Systemkonfektionierung 229
6.10.3 Peakkapazität versus Realprobe 229
6.11 Abschließende Bemerkungen 230
Literatur 231
7 Materialien in HPLC und UHPLC was für welchen Zweck? 233
Tobias Fehrenbach und Steffen Wiese
7.1 Abkürzungsverzeichnis 233
7.2 Überblick 234
7.3 Anforderungen an Materialien einer UHPLC 235
7.3.1 Mechanische Beständigkeit 236
7.3.2 Chemische Beständigkeit 236
7.3.3 Kompatibilität zum Analyten/Biokompatibilität 237
7.4 Flusswege in einem UHPLC-System 238
7.4.1 Niederdruck- und Hochdruckflussweg 238
7.4.2 Flussweg der mobilen Phase und der Probe 239
7.5 Niederdruckflussweg 240
7.6 Hochdruckflussweg 242
7.6.1 Pumpe 242
7.6.2 Autosampler 249
7.6.3 Kapillaren und Verschraubungen 255
7.7 Wann und warum kann ein inertes UHPLC-System erforderlich sein? 260
7.7.1 Begriff der Inertheit 261
7.7.2 Natur der Passivschicht 262
7.7.3 Anforderungen und Wechselwirkungen 266
7.7.4 Passivierungsstrategien und -methoden 272
Literatur 275
Teil 2 Erfahrungsberichte, Trends 281
8 Wasmussdie Software können, damitdie Hardware optimal genutzt werden kann? 283
A. Simon
8.1 Einführung 283
8.2 Funktionalität und Bedienung 284
8.3 Integration 284
8.4 Gerätesteuerung 285
8.5 Bedienung 286
8.6 Ease of Use 287
8.7 Bedienoberflächen 288
8.8 Multilingual 289
8.9 Austausch von Daten 290
8.10 Datenimport und -export 291
8.11 Skalierbarkeit vom PC bis zur globalen Installation 292
9 Aspekte der modernen HPLC Erfahrungsbericht eines Anwenders 295
Steffen Wiese
9.1 Einführung 295
9.2 Bestimmung des Gradientenverweilvolumens 295
9.3 Hochdurchsatztrennung (High Throughput Separations) 299
9.4 Methodentransfer zwischen UHPLC-Systemen unterschiedlicher Hersteller 302
9.5 Anwendung höherer Temperaturen 305
9.6 Injektion großer Volumina (Large Volume Injection, LVI) 307
9.7 UHPLC-Trennungen mit 1 mm Innendurchmesser Säulen 312
Literatur 315
10 Erfahrungsbericht eines unabhängigen Serviceingenieurs Tipps und Empfehlungen für einen optimalen Betrieb von Agilent- und Waters-Anlagen im Alltag 317
S. Chroustovsky
10.1 Einleitung 317
10.2 Der Degasser, Prinzipien 317
10.2.1 Verschiedene Hersteller, verschiedene Typen 318
10.3 Die Pumpe, Prinzipien 319
10.3.1 Verschiedene Hersteller, verschiedene Typen 321
10.4 Autosampler, Prinzipien 322
10.4.1 Verschiedene Hersteller, verschiedene Typen 324
10.5 Die UV-Detektoren, Prinzipien 325
10.5.1 Verschiedene Hersteller, verschiedene Typen 326
11 Der Analyt, die Fragestellung und die UHPLC der Einsatz von UHPLC in der Praxis 329
S. Lamotte
11.1 Einleitung 329
11.2 Wann ist der Einsatz von UHPLC sinnvoll und wann eher nicht? 329
11.3 Freisetzungstests in der pharmazeutischen Industrie 331
11.4 Methodenentwicklung und -optimierung 331
11.5 Klassische flüssigchromatographische Analytik 332
11.6 Schnelle (meist zweite) Dimension der multidimensionalen Chromatographie 332
11.7 Trennung von (Bio)polymeren 333
11.8 Prozessanalysentechnik (PAT) 334
Literatur 334
12 Gerätehersteller berichten 335
12.1 Agilent Technologies, Waldbronn 335
J. Trafkowski
Literatur 345
12.2 Shimadzu, Duisburg 346
B.-T. Erxleben
12.3 Thermo Fisher Scientific, Germering 352
F. Steiner
12.3.1 Anforderungen an das gesamte System und wie die Erfahrung gelehrt hat diese zu meistern 352
12.3.2 Die Eluentenförderungseinheit, weit mehr als eine Hochdruckpumpe 357
12.3.3 Der Probengeber für das robuste Ausführen ultrapräziser Analysen, auch im Hochdurchsatz 358
12.3.4 Neue Wege der Säulenthermostatisierung für die beste Trennleistung und Methodenübertragbarkeit 360
12.3.5 Auch eine exzellente ultraschnelle Trennung muss von einem Detektor aufgezeichnet werden 361
12.3.6 2D-LC zur Steigerung der Peakkapazität und andere Wege zu diesem Ziel sowie zur Steigerung der Produktivität 364
Über die Autoren 367
Index 371
